لا يزال التعقيد النسخي للدماغ غير موصوف جيداً على مستوى الأشكال الإسوية: القراءات القصيرة (حوالي 200 زوج قاعدي) لا تستطيع تجميع النصوص الكاملة، بينما البروتوكولات اليدوية للتسلسل طويل القراءة شاقة وحساسة لتدهور الحمض النووي الريبوزي في الأنسجة بعد الوفاة. ظهرت حول هذه المهمة أعمال لأتمتة تحليل البيانات الخلوية وتطبيق الشبكات العصبية على الإشارات الفيزيائية، لكن لم يكن هناك حل متكامل وقابل للتوسع للدماغ البشري بعد الوفاة.
تقوم SALRR بأتمتة تحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين التكميلي (cDNA) من Oxford Nanopore على منصة Hamilton Microlab NGS STAR، مما يقلل الوقت اليدوي بنسبة 67% ويرفع الإنتاجية من 8 إلى 24 مكتبة للشخص في اليوم. يتضمن الجزء الحسابي على Snakemake استدعاء القواعد Dorado، وتصفية القراءات كاملة الطول Pychopper، والمحاذاة minimap2 على الجينوم GRCh38، وإعادة بناء النصوص IsoQuant وStringTie مع الدمج اللاحق عبر Isomatch، وتصنيف الأشكال الإسوية الجديدة حسب الفئات البنيوية SQANTI. لمراقبة الجودة والمعايرة استُخدمت ضوابط spike-in من SIRV-Set 4.
على 13 مكتبة، تم الحصول على متوسط 68.8 مليون قراءة، بطول وسيط 2,064 زوج قاعدي، وجودة Q24.91، ونسبة محاذاة 99.93%. لا يقل التحضير الآلي عن اليدوي في إنتاج المكتبات ونسبة المحاذاة، مع انخفاض طفيف فقط في الطول الوسيط للقراءات المحاذية (1.7 مقابل 2.0 ألف زوج قاعدي). عند RIN من 8.2 إلى 10، ارتبط إنتاج المكتبات بـ RIN (r=0.70)، لكن عدد القراءات والنصوص الموصوفة بقي مستقراً. بلغ الارتباط في التعبير مع القراءات القصيرة r=0.742 على مستوى الجينات وr=0.760 على مستوى النصوص؛ ودقة التقدير الكمي وفق ضوابط ERCC بين r=0.939 و0.943. تم اكتشاف 31,607 شكل إسوي معبر عنه من 10,075 جيناً، منها 8,532 جديدة (27%)، مع غلبة احتفاظ الإنترونات، وتوليفات جديدة من الوصلات المعروفة، ونهايات 3' بديلة. في مواقع GBA1 وCCNF وCHCHD10 وTREM2، حللت القراءات الطويلة أشكالاً إسوية أكثر من القصيرة، بما في ذلك شكلان إسويان جديدان لـ GBA1 (ISOMT_8486 وISOMT_8487) ببنية 5' بديلة.
على عكس الأعمال المجاورة حول تطبيق التعلم الآلي على البيانات الخلوية والفيزيائية، تحل SALRR مهمة بيولوجية بحتة: تجعل التسلسل طويل القراءة للدماغ قابلاً للتكرار والتوسع. إنها أول منصة تعالج في آن واحد الإنتاجية المنخفضة للبروتوكولات اليدوية، والحساسية لجودة الحمض النووي الريبوزي، وتشتت الأدوات الحسابية. وتفتح إمكانية إجراء دراسات سكانية لتنوع الأشكال الإسوية في التنكس العصبي، والتي كانت غير قابلة للتنفيذ سابقاً.
تسمح البنية المعيارية لـ SALRR بإضافة تقنيات جديدة دون إعادة تصميم. التوسع إلى تسلسل الحمض النووي الريبوزي طويل القراءة أحادي الخلية والمكاني سيتيح الاستخدام الخاص بكل خلية للأشكال الإسوية، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم عدم التجانس في الأمراض التنكسية العصبية. تُطبق المنصة بالفعل على مئات عينات الدماغ في مرض ألزهايمر والخرف المرتبط به في إطار مبادرة CARD Long-Read Sequencing Initiative.
ستؤثر النتائج على علم الجينوم العصبي، وعلم النسخ السكاني، وأبحاث الأمراض التنكسية العصبية، من خلال توفير دقة الأشكال الإسوية التي لا تستطيع القراءات القصيرة تحقيقها.
تطبيق SALRR على أتراب كبيرة من الدماغ بعد الوفاة، بما في ذلك مئات عينات CARD، ودمج البيانات مع ملفات جينومية وإيبيجينية طويلة القراءة متوافقة من نفس المتبرعين.
يرتبط العمل مباشرة بمشكلة غير محلولة في علم الجينوم العصبي: كيف يؤثر تبديل الأشكال الإسوية على وظيفة الخلايا العصبية والقابلية للإصابة بالأمراض، عندما لا يتغير التعبير الجيني الكلي. توفر SALRR أداة لرسم خرائط منهجية لمثل هذه الأحداث في الدماغ البشري.
بلغ الطول الوسيط لذيل بولي (A) في النصوص النووية 143 نيوكليوتيدة، بينما كان في النصوص الميتوكوندرية 41 فقط، مما يعكس سمة معروفة للحمض النووي الريبوزي الرسول الميتوكوندري.
في رواية غريغ إيغان «المدينة المُرتَّبة» (Permutation City)، يتطلب نسخ الوعي فك تشفير كامل للحالات الجزيئية للخلايا العصبية؛ وتقرب SALRR الواقع من هذا المستوى من التفصيل، بإظهار تنوع الأشكال الإسوية الذي كان غير مرئي سابقاً.
لم يُنشر على arXiv. هنا صفحته وملف PDF والصياغة الشكلية: يمكنك التحقق بنفسك، لا مجرد قراءة تحليلنا.