Старение — общий фактор риска для многих заболеваний глаз, включая возрастную макулярную дегенерацию, глаукому, катаракту и диабетическую ретинопатию. Традиционные модельные организмы, такие как мыши и рыбки данио, живут слишком долго, что затрудняет изучение возрастных изменений. Африканская киллифиш (Nothobranchius furzeri) — самое короткоживущее позвоночное, размножающееся в лаборатории (4–6 месяцев), и у неё наблюдаются многие признаки старения, включая повреждение ДНК, клеточное старение и снижение остроты зрения. Однако существующие геномные ресурсы для киллифиш ограничены: старый референс Nfu_20140520 неполон, а новый NfurGRZ-RIMD1, хотя и более полный, имеет плохо аннотированный транскриптом (почти половина генов названа как 'LOC###'). Это ограничивает анализ экспрессии генов и интеграцию с эпигенетическими данными. Работа заполняет этот пробел, создавая улучшенный транскриптом сетчатки на основе длинных прочтений РНК.
Сетчатки молодых (8 недель) и старых (22 недели) киллифиш были использованы для выделения тотальной РНК. Библиотеки полноразмерной кДНК готовили по протоколу PacBio Kinnex, затем секвенировали на платформе PacBio Revio. Полученные длинные прочтения обрабатывали пайплайном Iso-Seq: демультиплексирование, идентификация полноразмерных нехимерных транскриптов, кластеризация и коллапс изоформ. Затем транскрипты классифицировали и фильтровали с помощью SQANTI3, используя 37 опубликованных наборов bulk RNA-seq сетчатки для валидации сплайс-сайтов. Открытые рамки считывания предсказывали программой TransDecoder, а функциональную аннотацию проводили EggNOG-mapper с использованием ортологии к костистым рыбам. Для проверки полезности нового транскриптома повторно анализировали опубликованные данные bulk RNA-seq (14 тканей) и single-cell RNA-seq (сетчатка 6, 12 и 18 недель), сравнивая картирование на три референса: Nfu_20140520, NfurGRZ-RIMD1 и новый PacBio транскриптом.
Новый транскриптом содержит 21 014 генов и 165 015 транскриптов, из которых более 53% — новые изоформы. Доля генов с биологически значимыми названиями выросла с 52,9% у NfurGRZ-RIMD1 до 71,9%, а доля 'LOC###' снизилась с 47,1% до менее 1%. При повторном картировании bulk RNA-seq доля картированных чтений увеличилась для большинства тканей, особенно для нервных (сетчатка, мозг, спинной мозг), но снизилась для печени, жира и кишечника. В single-cell RNA-seq доля картированных чтений выросла на 6–8% по сравнению с NfurGRZ-RIMD1 и на 10–12% по сравнению с Nfu_20140520, а количество обнаруженных клеток увеличилось на 24–26%. Дифференциальный анализ экспрессии между 21- и 7-недельными сетчатками выявил 1683 гена, из которых 80,2% имеют ортологичные названия у человека. Среди них подтвердились ранее валидированные гены optn, nfkb2 и pcdh15. Анализ траекторий экспрессии выявил кластеры, связанные со старением: снижение экспрессии митохондриальных и трансляционных генов, повышение генов воспаления, ангиогенеза и ремоделирования внеклеточного матрикса. Новый транскриптом также позволил правильно аннотировать гены, отсутствовавшие ранее, включая crx, nr2e3, rho и другие. Обнаружена возрастная потеря экспрессии одного из двух тандемно дуплицированных генов зеленого опсина rh2 (PB.6621), подтверждённая гибридизационной цепной реакцией in situ.
Работа предоставляет улучшенный транскриптом сетчатки киллифиш, который повышает точность анализа экспрессии генов при старении. По сравнению с предыдущими ресурсами, новый транскриптом содержит больше полноразмерных изоформ и функциональных аннотаций, что позволяет проводить более полный анализ путей и биологическую интерпретацию. В отличие от недавнего исследования телэнцефалона, данная работа использует новую хромосомную сборку NfurGRZ-RIMD1 и включает прямое сравнение трёх референсов на одних и тех же данных, демонстрируя преимущества нового ресурса. Это делает киллифиш более мощной моделью для изучения возрастных заболеваний сетчатки.
В будущем потребуется создать консенсусный транскриптом, полезный для всех тканей киллифиш, так как текущий ресурс оптимизирован для сетчатки и нервной системы. Также необходима интеграция с эпигенетическими данными для изучения механизмов старения. Улучшение аннотации генома и транскриптома откроет возможности для исследований на уровне изоформ и регуляции сплайсинга при старении.
Новый транскриптом улучшит исследования старения сетчатки и нейродегенерации на модели киллифиш. Он также может быть полезен для сравнительной геномики рыб и изучения эволюции зрительных пигментов.
Следующим шагом будет расширение транскриптома на другие ткани и создание единого референса для всего организма. Также планируется использовать новый ресурс для детального анализа возрастных изменений сплайсинга и изоформ в сетчатке.
Работа решает проблему неполной аннотации генома у новой модельной системы, что ограничивало интерпретацию транскриптомных данных. Это напрямую связано с нерешёнными вопросами о молекулярных механизмах возрастных заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, где изменения экспрессии генов играют ключевую роль.
Африканская киллифиш живёт всего 4–6 месяцев, но её сетчатка стареет так же, как у человека: накапливаются повреждения ДНК и снижается острота зрения. При этом у неё есть два почти одинаковых гена зеленого опсина, и с возрастом один из них «замолкает».
В романе Алана Дина Фостера «Дар никчёмного человека» инопланетяне живут очень коротко, но обладают сложной биологией. Киллифиш, как модель ускоренного старения, напоминает такие фантастические виды, позволяя изучать процессы, которые у человека растянуты на десятилетия.
Работа опубликована не на arXiv. Здесь её страница, PDF и формализация: проверить можно самим, а не только прочитать наш разбор.