La cristalización de proteínas es la base de la biología estructural y de los procesos industriales de separación, pero predecir y controlar sus rutas sigue siendo difícil. La teoría clásica de la nucleación describe la cristalización como un proceso aleatorio en el que los monómeros se ensamblan en un núcleo crítico, tras lo cual comienza el crecimiento del cristal. Sin embargo, para muchas proteínas, incluida la ferritina, este modelo no explica toda la diversidad de fenómenos observados. Cada vez más datos apuntan a rutas alternativas no clásicas, que incluyen fases intermedias metaestables, separación de fases líquida o precursores amorfos. El trabajo está en un terreno aparte: cerca, en el archivo, hay estudios sobre proteínas en haces, filamentos en flujo, cristales con memoria y elasticidad de líquidos en trampas, pero no hay vecinos directos sobre la cristalización de ferritina en gotas levitantes. Este es el primer intento de combinar la levitación acústica con la dispersión de rayos X para mapear las rutas de cristalización en tiempo real.
Una gota de disolución de ferritina con polietilenglicol (PEG) y sal de aproximadamente 10 microlitros se introdujo en un levitador acústico ultrasónico que funciona a una frecuencia de 100 kHz. La gota se evaporaba y su volumen disminuía, lo que provocaba un aumento de la concentración de proteína y polímero. Simultáneamente, se hacía pasar un haz de rayos X a través de la gota en la estación CoSAXS de MAX IV (Lund, Suecia) con una energía de 18 keV y un tamaño de haz de 100×100 micrómetros. Los detectores registraban la dispersión de ángulo pequeño (SAXS) y de ángulo amplio (WAXS) con una exposición de 0,1 segundos. Un microscopio óptico fotografiaba la gota para estimar el volumen. Se midió el factor de estructura de la proteína, que muestra cómo están organizadas las proteínas entre sí, y la intensidad de los picos de Bragg, que indican orden cristalino. Se varió la concentración de PEG (0, 3, 5, 7 por ciento en masa) y su masa molecular (1000 y 6000 g/mol).
Al evaporarse la gota con PEG6000, la proteína primero permanecía en disolución, luego, a una concentración de alrededor de 400–500 mg/ml, aparecían picos de Bragg que indicaban la formación de cristales. Sin embargo, al continuar la deshidratación, los picos desaparecían, es decir, los cristales perdían el orden. Este proceso coincidió en el tiempo con el inicio de la semicristalización del propio PEG, pero los autores mostraron que la pérdida de orden no era causada por el polímero. El factor de estructura a ángulos pequeños mostró que antes de la cristalización actúan fuerzas de atracción entre las proteínas, lo que es característico de una ruta controlada por interacciones directas entre partículas. Al sustituir el PEG6000 por PEG1000, el panorama cambió: la cristalización comenzaba más tarde, ya con un volumen de gota casi constante, y los cristales permanecían estables hasta el final del experimento. Las interacciones entre las proteínas eran predominantemente repulsivas, y la cristalización ocurría a alta concentración, lo que indica una ruta controlada por efectos de volumen excluido, como en un sistema de esferas duras. La distancia entre proteínas en el cristal para el PEG1000 era mayor que para el PEG6000, lo que confirma la diferencia en el empaquetamiento.
El trabajo se distingue de los vecinos porque por primera vez relaciona la masa molecular del polímero con la elección de la ruta de cristalización y la estabilidad de los cristales de proteína en condiciones de concentración continua. Los estudios cercanos examinaban proteínas en haces o la elasticidad de un líquido en una trampa, pero no consideraban la cinética de cristalización en una gota levitante. Aquí se muestra que las cadenas cortas de PEG1000 estabilizan los cristales durante la deshidratación, posiblemente gracias a la adsorción en la superficie de la proteína y a la retención de agua. Esto proporciona una herramienta sencilla para mejorar los protocolos de cristalización en biología estructural, donde a menudo se necesitan cristales estables para el análisis por difracción de rayos X.
El método de levitación acústica con dispersión de rayos X puede extenderse a otras proteínas y polímeros para construir mapas de rutas de cristalización. Es interesante comprobar cómo la adsorción de PEG de diferente longitud influye en el entorno local de la proteína en el cristal, por ejemplo, mediante modelado molecular o dispersión de neutrones. También se puede investigar el papel de la velocidad de evaporación y la concentración inicial de sal para controlar la nucleación y el crecimiento de los cristales.
Los resultados influirán en la biología estructural, donde se necesitan cristales estables para determinar la estructura de proteínas, y en la farmacéutica, donde la cristalización de preparados proteicos es importante para la purificación y la formulación.
El siguiente paso será comprobar la hipótesis de la adsorción de PEG1000 en la superficie de la ferritina mediante espectroscopia o cálculos, así como probar otros polímeros con diferente longitud de cadena.
El trabajo está directamente relacionado con el problema no resuelto de predecir rutas no clásicas de cristalización de proteínas, donde la teoría clásica de la nucleación no funciona. Muestra cómo los parámetros moleculares de los aditivos pueden cambiar el mecanismo de cristalización, lo que es importante para controlar el polimorfismo y la calidad de los cristales.
Una gota de 10 microlitros se evapora en el levitador en aproximadamente 20 minutos, y durante ese tiempo la concentración de proteína crece de 50 a 500 mg/ml, es decir, 10 veces.
En la novela «Solaris» de Stanisław Lem, el océano crea estructuras que no se pueden entender con métodos terrestres; aquí, en cambio, vemos cómo un polímero simple controla el nacimiento y la muerte de cristales de proteína en una gota que flota en el aire.