La cristallisation des protéines est au cœur de la biologie structurale et des procédés industriels de séparation, mais il reste difficile d'en prévoir et d'en contrôler les voies. La théorie classique de la nucléation décrit la cristallisation comme un processus aléatoire dans lequel les monomères s'assemblent en un germe critique, après quoi commence la croissance du cristal. Cependant, pour de nombreuses protéines, dont la ferritine, ce modèle n'explique pas toute la diversité des phénomènes observés. De plus en plus de données pointent vers des voies non classiques alternatives, impliquant des phases intermédiaires métastables, une séparation de phases liquide-liquide ou des précurseurs amorphes. Ce travail fait figure d'exception : à côté, dans les archives, on trouve des études sur des protéines dans des faisceaux, des filaments dans un flux, des cristaux à mémoire et l'élasticité d'un liquide dans un piège, mais aucun voisin direct sur la cristallisation de la ferritine dans des gouttes en lévitation. C'est la première tentative de combiner la lévitation acoustique et la diffusion des rayons X pour cartographier les voies de cristallisation en temps réel.
Une goutte de solution de ferritine avec du polyéthylène glycol (PEG) et du sel, d'un volume d'environ 10 microlitres, était introduite dans un lévitateur acoustique à ultrasons fonctionnant à une fréquence de 100 kHz. La goutte s'évaporait et son volume diminuait, ce qui faisait augmenter la concentration de protéine et de polymère. Simultanément, un faisceau de rayons X traversait la goutte sur la ligne CoSAXS du MAX IV (Lund, Suède), avec une énergie de 18 keV et une taille de faisceau de 100×100 micromètres. Des détecteurs enregistraient la diffusion aux petits angles (SAXS) et aux grands angles (WAXS) avec une exposition de 0,1 seconde. Un microscope optique filmait la goutte pour estimer son volume. On mesurait le facteur de structure de la protéine, qui montre comment les protéines sont organisées les unes par rapport aux autres, et l'intensité des pics de Bragg, signe d'un ordre cristallin. On faisait varier la concentration de PEG (0, 3, 5, 7 pour cent en masse) et sa masse moléculaire (1000 et 6000 g/mol).
Lors de l'évaporation de la goutte avec le PEG6000, la protéine restait d'abord en solution, puis, à une concentration d'environ 400–500 mg/ml, des pics de Bragg apparaissaient, indiquant la formation de cristaux. Cependant, lors de la déshydratation ultérieure, les pics disparaissaient, c'est-à-dire que les cristaux perdaient leur ordre. Ce processus coïncidait dans le temps avec le début de la semi-cristallisation du PEG lui-même, mais les auteurs ont montré que la perte d'ordre n'était pas causée par le polymère. Le facteur de structure aux petits angles a montré qu'avant la cristallisation, des forces attractives s'exerçaient entre les protéines, ce qui est caractéristique d'une voie gouvernée par des interactions directes entre particules. En remplaçant le PEG6000 par le PEG1000, le tableau a changé : la cristallisation commençait plus tard, alors que le volume de la goutte était déjà presque constant, et les cristaux restaient stables jusqu'à la fin de l'expérience. Les interactions entre protéines étaient majoritairement répulsives, et la cristallisation se produisait à haute concentration, ce qui indique une voie gouvernée par des effets de volume exclu, comme dans un système de sphères dures. La distance entre protéines dans le cristal était plus grande pour le PEG1000 que pour le PEG6000, ce qui confirme une différence d'empilement.
Ce travail se distingue de ses voisins en ce qu'il relie pour la première fois la masse moléculaire du polymère au choix de la voie de cristallisation et à la stabilité des cristaux de protéines dans des conditions de concentration continue. Les études voisines portaient sur des protéines dans des faisceaux ou sur l'élasticité d'un liquide dans un piège, mais n'examinaient pas la cinétique de cristallisation dans une goutte en lévitation. Ici, il est montré que les chaînes courtes de PEG1000 stabilisent les cristaux lors de la déshydratation, peut-être grâce à une adsorption à la surface de la protéine et à une rétention de l'eau. Cela fournit un outil simple pour améliorer les protocoles de cristallisation en biologie structurale, où il faut souvent obtenir des cristaux stables pour l'analyse par diffraction des rayons X.
La méthode de lévitation acoustique couplée à la diffusion des rayons X peut être étendue à d'autres protéines et polymères afin de construire des cartes des voies de cristallisation. Il serait intéressant de vérifier comment l'adsorption de PEG de différentes longueurs influence l'environnement local de la protéine dans le cristal, par exemple à l'aide de la modélisation moléculaire ou de la diffusion de neutrons. On peut aussi étudier le rôle de la vitesse d'évaporation et de la concentration initiale en sel pour contrôler la nucléation et la croissance des cristaux.
Les résultats auront un impact sur la biologie structurale, où l'on a besoin de cristaux stables pour déterminer la structure des protéines, et sur la pharmacie, où la cristallisation des préparations protéiques est importante pour la purification et la formulation.
La prochaine étape consistera à tester l'hypothèse de l'adsorption du PEG1000 à la surface de la ferritine par spectroscopie ou par calculs, ainsi qu'à expérimenter d'autres polymères de différentes longueurs de chaîne.
Ce travail est directement lié au problème non résolu de la prévision des voies non classiques de cristallisation des protéines, où la théorie classique de la nucléation ne fonctionne pas. Il montre comment les paramètres moléculaires des additifs peuvent faire basculer le mécanisme de cristallisation, ce qui est important pour contrôler le polymorphisme et la qualité des cristaux.
Une goutte de 10 microlitres s'évapore dans le lévitateur en environ 20 minutes, et pendant ce temps la concentration de protéine passe de 50 à 500 mg/ml, soit un facteur 10.
Dans le roman « Solaris » de Stanislas Lem, l'océan crée des structures impossibles à comprendre par les méthodes terrestres ; ici, nous voyons au contraire comment un simple polymère gouverne la naissance et la mort de cristaux de protéines dans une goutte suspendue dans l'air.