La secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) se ha convertido en el estándar para estudiar la heterogeneidad celular, pero las distintas plataformas emplean químicas de captura y de código de barras diferentes. Esto genera sesgos técnicos que resulta difícil separar de la variación biológica. Junto a este trabajo, en el archivo hay estudios sobre secuenciación de ADN, lectura de ADN con redes neuronales, análisis de redes génicas y agrupamiento celular. Este artículo va por su cuenta: se centra en comparar plataformas y en cuantificar el ruido transcripcional, algo que los trabajos vecinos no cubren.
Los investigadores aislaron núcleos de células de la línea linfoblastoide GM12878 y realizaron cuatro réplicas técnicas para cada plataforma. Para 10x Chromium usaron codificación por microfluídica con cebadores oligo(dT), y para Parse Evercode WT, codificación combinatoria en split-pool con hexámeros aleatorios y oligo(dT). Además, hicieron un experimento con células enteras en 10x. Las bibliotecas se secuenciaron en Illumina y los datos se procesaron con Cell Ranger (10x) y Split-Pipe (Parse). Para evaluar el ruido usaron dos métodos independientes: la puntuación z estratificada y el parámetro de sobredispersión del paquete BASiCS.
Parse Evercode WT alcanzó casi el 100% de la profundidad de secuenciación y del número de células objetivo, mientras que 10x Chromium falló en cada experimento (se pasó por un factor de 2 o se quedó corto por un factor de 2). Ambas plataformas detectaron alrededor de 3500 genes por núcleo con 50 000 lecturas, pero 10x tenía un sesgo marcado hacia el extremo 3', y Parse, hacia el extremo 5' y una preferencia por genes y exones largos. Parse captaba mejor los transcritos no poliadenilados (por ejemplo, el lncRNA TALAM1), y 10x, los marcadores poliadenilados de células B (IGHD, CD79A, CD81). Las células se agruparon según la plataforma, lo que indica un fuerte sesgo técnico. El resultado clave: el ruido transcripcional es reproducible entre plataformas (correlación de rangos de 0.46–0.70 entre experimentos), disminuye en la fase G2M del ciclo celular y correlaciona positivamente con la longitud del gen (cobertura genómica), pero no con la longitud total de los exones. Los genes con una isla CpG en el promotor son menos ruidosos que los que carecen de ella.
El trabajo muestra que el ruido transcripcional, medido como la varianza residual tras eliminar la dependencia de la media, es una propiedad de los genes transferible entre plataformas. Esto lo distingue de los estudios vecinos, que o bien se centran en un solo método o bien no comprueban la reproducibilidad del ruido entre químicas. Por primera vez se demuestra que la métrica de ruido no es un artefacto de una plataforma concreta, lo que abre el camino a combinar conjuntos de datos públicos heterogéneos para analizar el ruido.
El tema puede avanzar hacia el estudio de los mecanismos que vinculan la longitud del gen y la arquitectura del promotor con el ruido. Quizá intervengan el estrés topológico durante la elongación, los elementos reguladores en los intrones o la cinética de los estallidos transcripcionales. También es prometedor investigar el ruido en células sincronizadas para separar la contribución del ciclo celular de otros factores.
Los resultados influirán en el diseño de experimentos de scRNA-seq y en la interpretación de datos procedentes de distintas plataformas. También son importantes para la investigación de la regulación transcripcional y la heterogeneidad celular.
El siguiente paso puede ser comprobar la relación entre el ruido y la longitud del gen en otras líneas celulares y tejidos, así como estudiar el papel de las islas CpG en la reducción del ruido mediante experimentos dirigidos.
En el campo de la transcriptómica de células individuales sigue sin resolverse la pregunta de qué factores biológicos determinan el nivel de ruido de la expresión génica. Este trabajo vincula el ruido con la longitud del gen y la arquitectura del promotor, pero no desvela el mecanismo molecular. También persiste el problema de integrar datos de distintas plataformas debido a los sesgos técnicos.
La plataforma Parse Evercode WT utiliza codificación combinatoria: las células se mezclan y se separan sucesivamente, recibiendo combinaciones únicas de códigos de barras, como si cada célula obtuviera su propio código postal.
No publicado en arXiv. Aquí están su página, el PDF y la formalización: puede comprobarlo usted mismo, no solo leer nuestro análisis.