Le vieillissement est un facteur de risque commun à de nombreuses maladies oculaires, notamment la dégénérescence maculaire liée à l'âge, le glaucome, la cataracte et la rétinopathie diabétique. Les organismes modèles traditionnels, comme la souris et le poisson-zèbre, vivent trop longtemps, ce qui complique l'étude des changements liés à l'âge. Le killifish africain (Nothobranchius furzeri) est le vertébré à la durée de vie la plus courte capable de se reproduire en laboratoire (4–6 mois), et il présente de nombreux signes de vieillissement, notamment des dommages à l'ADN, une sénescence cellulaire et une baisse de l'acuité visuelle. Toutefois, les ressources génomiques existantes pour le killifish sont limitées : l'ancienne référence Nfu_20140520 est incomplète, et la nouvelle NfurGRZ-RIMD1, bien que plus complète, possède un transcriptome mal annoté (près de la moitié des gènes sont nommés « LOC### »). Cela limite l'analyse de l'expression génique et l'intégration avec les données épigénétiques. Ce travail comble cette lacune en créant un transcriptome amélioré de la rétine à partir de lectures longues d'ARN.
Des rétines de killifish jeunes (8 semaines) et âgés (22 semaines) ont été utilisées pour extraire l'ARN total. Les banques d'ADNc pleine longueur ont été préparées selon le protocole PacBio Kinnex, puis séquencées sur la plateforme PacBio Revio. Les lectures longues obtenues ont été traitées par le pipeline Iso-Seq : démultiplexage, identification des transcrits pleine longueur non chimériques, clustering et effondrement des isoformes. Ensuite, les transcrits ont été classés et filtrés avec SQANTI3, en utilisant 37 jeux de données publiés de RNA-seq bulk de la rétine pour valider les sites d'épissage. Les cadres de lecture ouverts ont été prédits par le programme TransDecoder, et l'annotation fonctionnelle a été réalisée avec EggNOG-mapper en s'appuyant sur l'orthologie avec les poissons téléostéens. Pour vérifier l'utilité du nouveau transcriptome, les données publiées de RNA-seq bulk (14 tissus) et de RNA-seq single-cell (rétine à 6, 12 et 18 semaines) ont été réanalysées, en comparant la cartographie sur trois références : Nfu_20140520, NfurGRZ-RIMD1 et le nouveau transcriptome PacBio.
Le nouveau transcriptome contient 21 014 gènes et 165 015 transcrits, dont plus de 53 % sont de nouvelles isoformes. La proportion de gènes portant des noms biologiquement significatifs est passée de 52,9 % pour NfurGRZ-RIMD1 à 71,9 %, et la part de « LOC### » a chuté de 47,1 % à moins de 1 %. Lors de la recartographie des RNA-seq bulk, la proportion de lectures cartographiées a augmenté pour la plupart des tissus, en particulier les tissus nerveux (rétine, cerveau, moelle épinière), mais a diminué pour le foie, la graisse et l'intestin. En RNA-seq single-cell, la proportion de lectures cartographiées a augmenté de 6–8 % par rapport à NfurGRZ-RIMD1 et de 10–12 % par rapport à Nfu_20140520, et le nombre de cellules détectées a augmenté de 24–26 %. L'analyse différentielle de l'expression entre les rétines de 21 et 7 semaines a identifié 1 683 gènes, dont 80,2 % portent des noms orthologues chez l'humain. Parmi eux, les gènes optn, nfkb2 et pcdh15, déjà validés, ont été confirmés. L'analyse des trajectoires d'expression a révélé des groupes liés au vieillissement : diminution de l'expression des gènes mitochondriaux et de traduction, augmentation des gènes de l'inflammation, de l'angiogenèse et du remodelage de la matrice extracellulaire. Le nouveau transcriptome a également permis d'annoter correctement des gènes auparavant absents, notamment crx, nr2e3, rho et d'autres. Une perte d'expression liée à l'âge de l'un des deux gènes d'opsine verte rh2 dupliqués en tandem (PB.6621) a été découverte, confirmée par hybridation in situ en chaîne par polymérase.
Ce travail fournit un transcriptome amélioré de la rétine du killifish, qui accroît la précision de l'analyse de l'expression génique lors du vieillissement. Par rapport aux ressources précédentes, le nouveau transcriptome contient davantage d'isoformes pleine longueur et d'annotations fonctionnelles, ce qui permet une analyse plus complète des voies et une meilleure interprétation biologique. Contrairement à une récente étude du télencéphale, ce travail utilise le nouvel assemblage chromosomique NfurGRZ-RIMD1 et inclut une comparaison directe des trois références sur les mêmes données, démontrant les avantages de la nouvelle ressource. Cela fait du killifish un modèle plus puissant pour l'étude des maladies rétiniennes liées à l'âge.
À l'avenir, il faudra créer un transcriptome consensuel utile pour tous les tissus du killifish, car la ressource actuelle est optimisée pour la rétine et le système nerveux. Une intégration avec les données épigénétiques sera également nécessaire pour étudier les mécanismes du vieillissement. L'amélioration de l'annotation du génome et du transcriptome ouvrira la voie à des recherches au niveau des isoformes et de la régulation de l'épissage lors du vieillissement.
Le nouveau transcriptome améliorera les recherches sur le vieillissement de la rétine et la neurodégénérescence dans le modèle du killifish. Il pourra aussi être utile pour la génomique comparative des poissons et l'étude de l'évolution des pigments visuels.
La prochaine étape consistera à étendre le transcriptome à d'autres tissus et à créer une référence unique pour tout l'organisme. Il est également prévu d'utiliser cette nouvelle ressource pour analyser en détail les changements liés à l'âge dans l'épissage et les isoformes de la rétine.
Ce travail résout le problème de l'annotation incomplète du génome chez un nouveau système modèle, qui limitait l'interprétation des données transcriptomiques. Il est directement lié aux questions non résolues sur les mécanismes moléculaires des maladies rétiniennes liées à l'âge, comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge, où les changements d'expression génique jouent un rôle clé.
Le killifish africain ne vit que 4–6 mois, mais sa rétine vieillit comme celle de l'humain : les dommages à l'ADN s'accumulent et l'acuité visuelle diminue. En outre, il possède deux gènes d'opsine verte presque identiques, et avec l'âge, l'un d'eux « se tait ».
Dans le roman d'Alan Dean Foster « Le Don de l'homme inutile », les extraterrestres vivent très peu de temps mais possèdent une biologie complexe. Le killifish, modèle de vieillissement accéléré, rappelle ces espèces de science-fiction et permet d'étudier des processus qui, chez l'humain, s'étalent sur des décennies.
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