Изоаспартат (isoAsp) образуется, когда аспарагин или аспартат в белке спонтанно перестраивается через промежуточный аспартимид, вставляя дополнительную метиленовую группу в пептидный остов. Такая модификация обычно считается повреждением, связанным со старением, и накапливается в долгоживущих белках, например в кристаллинах хрусталика. Однако в рибосомном белке uS11 изоаспартат присутствует стехиометрически у бактерий, архей и эукариот, что указывает на его функциональную роль. Парадокс в том, что у кишечной палочки время удвоения около 20 минут, а спонтанное превращение аспарагина в изоаспартат занимает дни. Значит, должен существовать фермент, который ускоряет эту реакцию.
Чтобы найти кандидата, авторы использовали AlphaFold3 для предсказания комплексов uS11 со всеми 4403 белками протеома E. coli. Из всех белков только три дали уверенную модель связывания, и лишь YbeY располагал аспарагин-119 uS11 в каталитически компетентной позиции рядом с ионом цинка. Затем YbeY и uS11 экспрессировали и очищали, а образование изоаспартата детектировали масс-спектрометрией после трипсинолиза. Для проверки механизма использовали мутантные варианты YbeY, изотермическую калориметрию титрования для измерения связывания цинка и ЯМР-титрование комплекса из Thermotoga maritima. Филогенетический анализ 189 801 бактериального генома из базы GTDB позволил связать наличие YbeY с мотивом аспарагин-глицин в uS11.
YbeY из E. coli за один час in vitro превращает почти весь uS11 в форму с изоаспартатом в положении 119. Реакция зависит от цинка: добавление ЭДТА частично ингибирует её, а мутация H114A, нарушающая координацию цинка, снижает активность до 50%. Мутации остатков, участвующих в связывании субстрата (T42, R44, D85), также ослабляют катализ, тогда как замена R59A, важная для РНКазной активности YbeY, не влияет на образование изоаспартата. Это указывает на отдельный активный центр для модификации белка. Филогенетика показала, что потеря YbeY в бактериальных линиях сопровождается заменой аспарагина-119 на глицин или усечением uS11. У архей и эукариот роль YbeY, вероятно, выполняет АТФаза Fap7: в кристаллической структуре комплекса Fap7–uS11 из Pyrococcus abyssi авторы обнаружили, что остаток 124 на самом деле является изоаспартатом, а не аспартатом, как считалось ранее. Криоэлектронная микроскопия рибосом из штамма E. coli с удалённым ybeY показала, что отсутствие модификации не меняет укладку uS11, но нарушает связывание рибосомного белка bS21: его плотность в карте снижается, а контакт между аргинином-35 bS21 и изоаспартатом-119 uS11 исчезает. Рибосомы без YbeY хуже ассоциируют в 70S частицы и транслируют репортёрный белок лишь на 30% от нормы.
Работа превращает изоаспартат из маркера повреждения в регулируемую посттрансляционную модификацию, важную для сборки рибосомы. Открытие двух независимых ферментативных путей (YbeY у бактерий и Fap7 у архей и эукариот) показывает, что эта модификация возникла в эволюции как минимум дважды. Связь между изоаспартатом в uS11 и удержанием белка bS21 объясняет, почему мутации, нарушающие эту модификацию, приводят к дефектам трансляции и замедлению роста.
Остаётся выяснить, как именно YbeY координирует цинк и субстрат в переходном состоянии, и подтвердить предложенный механизм через аспартимидный интермедиат. Для Fap7 необходимо доказать, что он действительно фосфорилирует аспартат и катализирует изомеризацию, а не просто связывает uS11. Интересно также проверить, существуют ли другие белки, модифицируемые YbeY, и как изоаспартат в uS11 влияет на динамику рибосомы во время трансляции.
Результаты важны для молекулярной биологии трансляции, структурной биологии рибосом и понимания посттрансляционных модификаций. Они также могут быть полезны при разработке антибиотиков, нацеленных на YbeY, поскольку этот фермент консервативен у бактерий, но отсутствует у человека в цитоплазме.
Определить кристаллическую или крио-ЭМ структуру комплекса YbeY–uS11 в каталитически активном состоянии, чтобы увидеть координацию цинка и ориентацию субстрата. Проверить активность Fap7 in vitro с использованием очищенных белков и АТФ. Исследовать, какие ещё белки могут быть субстратами YbeY в клетке.
Работа связывает две фундаментальные проблемы молекулярной биологии: механизм сборки рибосомы и роль посттрансляционных модификаций в этом процессе. Она показывает, что изоаспартат, обычно рассматриваемый как спонтанное повреждение, может быть ферментативно создан для выполнения структурной функции. Это меняет взгляд на эволюцию рибосомных белков и на то, как клетки контролируют точность трансляции.
Спонтанное превращение аспарагина в изоаспартат в пептиде с мотивом Asn-Gly имеет период полураспада около 1,2 дня, но YbeY ускоряет эту реакцию до минут, что необходимо для сборки рибосомы за время клеточного цикла E. coli (около 20 минут).
Работа опубликована не на arXiv. Здесь её страница, PDF и формализация: проверить можно самим, а не только прочитать наш разбор.