Два разных микрофона записывают один и тот же концерт. Один микрофон стоит у сцены и ловит в основном громкие звуки с первого ряда, другой висит под потолком и слышит весь зал целиком, но с приглушёнными басами. Если сравнить записи, можно понять, какая часть шума в них — от микрофона, а какая — от самого оркестра. Примерно так же биологи сравнивают две платформы для секвенирования РНК одиночных клеток: 10x Chromium и Parse Evercode WT. Обе читают молекулы РНК из тысяч отдельных клеток, но каждая делает это по-своему, и до сих пор было неясно, можно ли доверять выводам о «транскрипционном шуме», полученным на одной из них.
Чтобы проверить, насколько шум зависит от способа записи, исследователи взяли клеточную линию GM12878 (это лимфобластоидные клетки человека) и выделили из неё ядра. Каждую платформу прогнали четыре раза, как если бы один и тот же концерт записали четыре раза на каждый микрофон. Дальше записи сравнили по трём параметрам: сколько всего молекул РНК поймано, какие именно гены видны лучше, и насколько сильно варьирует активность одного и того же гена от клетки к клетке. Первое, что бросилось в глаза: Parse почти идеально предсказал глубину секвенирования и число клеток, тогда как 10x то перелётывал в два раза, то недолётывал в два раза. При этом обе платформы детектировали около 3500 генов на ядро при 50 000 прочтений, но 10x лучше видел полиаденилированные транскрипты (то есть РНК с хвостом из аденинов), а Parse — неполиаденилированные, например длинную некодирующую РНК TALAM1.
Главный сюрприз ждал в анализе шума. Оказалось, что если после удаления зависимости от среднего уровня экспрессии измерить остаточную дисперсию (то есть насколько сильно активность гена пляшет вокруг своего среднего), то эта величина воспроизводима между платформами. Ранговая корреляция между экспериментами составила от 0.46 до 0.70. Иными словами, гены, которые шумят в записи с одного микрофона, шумят и в записи с другого. Причём шум оказался связан с длиной гена: чем длиннее ген, тем больше вариация. А вот суммарная длина экзонов (участков, которые остаются в зрелой РНК) на шум не влияла. Ещё одна деталь: гены, у которых в промоторе есть CpG-островок (участок ДНК, богатый парами цитозин-гуанин), шумели меньше, чем гены без такого островка.
Этот результат означает, что транскрипционный шум — не артефакт конкретной технологии, а свойство самого гена, которое можно переносить между платформами. Раньше исследователи, работавшие с разными наборами данных, не могли быть уверены, что сравнивают одно и то же. Теперь появилась точка опоры: если шум воспроизводится на разных химиях захвата, его можно изучать на объединённых данных из публичных архивов. Для практики это значит, что выбор платформы и глубины секвенирования можно делать осознаннее, а не наугад. Правда, механизм, связывающий длину гена и CpG-островки с шумом, пока не раскрыт. Возможно, дело в топологическом стрессе при удлинении транскрипта или в регуляторных элементах внутри интронов.
Если вернуться к метафоре с микрофонами: мы выяснили, что шипение в записи — не дефект конкретного микрофона, а особенность самой музыки. Теперь можно слушать разные записи одного концерта и не бояться, что мы слышим только искажения аппаратуры. Клетка продолжает играть свою партию, и мы наконец различаем её собственный стиль.
Платформа Parse Evercode WT использует комбинаторное штрихкодирование: клетки последовательно смешиваются и разделяются, получая уникальные комбинации штрихкодов, как будто каждая клетка получает свой почтовый индекс.
Работа опубликована не на arXiv. Здесь её страница, PDF и формализация: проверить можно самим, а не только прочитать наш разбор.