El peróxido de hidrógeno dejó hace tiempo de ser un simple producto secundario del metabolismo: actúa como molécula señalizadora que oxida de forma reversible los residuos de cisteína de las proteínas. Sin embargo, su acción depende no solo de la concentración, sino también del lugar dentro de la célula. Las mitocondrias, el núcleo, el citosol y la membrana plasmática tienen sus propios entornos redox, y una misma oleada de peróxido puede poner en marcha programas distintos en compartimentos distintos. Hasta ahora, los investigadores que trabajan con Drosophila no disponían de una herramienta que reuniera a la vez alta resolución temporal, precisión subcelular y capacidad de expresión específica de tejido. Los trabajos vecinos del archivo abordan la evolución, la transferencia horizontal de genes y procesos celulares, pero no tocan la medición directa de la dinámica redox in vivo con semejante control espacial.
Los autores crearon cuatro líneas de Drosophila, cada una de las cuales porta el gen HyPer7 bajo el control del promotor UAS, lo que permite activar la expresión en el tejido deseado mediante el sistema GAL4/UAS. Para dirigir el sensor se usaron secuencias señal: COX8 para la matriz mitocondrial, tres copias de NLS para el núcleo, NES para el citosol y miristoilación para la cara interna de la membrana plasmática. La expresión se comprobó en cultivo de células Kc167, en tejidos aislados (intestino medio, cuerpo graso, ovarios, discos imaginales) y en embriones vivos. La oxidación de HyPer7 se registró por el cambio en la relación de fluorescencia con excitación a 499 nm y 400 nm mediante microscopía confocal. Para inducir estrés oxidativo se emplearon paraquat y diamida, y para comprobar cambios fisiológicos, el envejecimiento y el desarrollo.
Las cuatro líneas son viables y muestran la localización subcelular esperada. En cultivo celular y en tejidos ex vivo, los sensores respondieron con rapidez a la adición de peróxido de hidrógeno o de diamida. En las mitocondrias de los ovarios, 100 µM de peróxido provocaron un rápido pico de oxidación seguido de una recuperación, lo que indica la activación de los sistemas antioxidantes. Al alimentar con paraquat, el sensor mitocondrial mostró una oxidación notable en el intestino medio y el cuerpo graso. En hembras viejas (56 días), el HyPer7 citosólico estaba más oxidado en los enterocitos del intestino que en las jóvenes (7 días). En los discos imaginales del ala se encontraron patrones específicos de cada compartimento: por ejemplo, el sensor nuclear aparece oxidado en la membrana peripodial, mientras que el sensor de membrana está reducido a lo largo de los límites dorsoventral y anteroposterior. En los embriones, la membrana plasmática mostró una oxidación alta en los gránulos de vitelo y en el borde anterior durante el cierre dorsal, mientras que el sensor nuclear se activó en las glándulas salivales en el estadio 14.
El trabajo llena un hueco metodológico: hasta ahora, en Drosophila se disponía o bien de la sonda mitocondrial MitoB, sin resolución subcelular, o bien de roGFP2-Orp1, limitada al citosol y a las mitocondrias y dependiente del sistema de glutatión. FlyPer añade el núcleo y la membrana plasmática, y además utiliza el sistema de reducción de tiorredoxina, lo que aporta información complementaria sobre la homeostasis redox. En comparación con los trabajos vecinos, centrados en redes genéticas o procesos evolutivos, este estudio ofrece una herramienta directa para visualizar la dinámica redox en tiempo real en el organismo vivo.
El conjunto FlyPer abre el camino a un mapeo sistemático del paisaje redox en distintos tejidos y en distintas etapas del desarrollo. Las líneas pueden combinarse con controladores específicos de tejido para estudiar el papel del peróxido de hidrógeno en poblaciones celulares concretas. Una mejora posterior podría incluir la creación de sistemas de expresión inducibles que minimicen la interferencia con la fisiología. También es prometedor combinarlo con proteómica redox para identificar las proteínas diana de la oxidación en compartimentos concretos.
La herramienta será útil en biología del desarrollo, gerontología, inmunología y en la investigación de la respuesta al estrés. Permite poner a prueba hipótesis sobre el papel de la señalización redox en la morfogénesis, la regeneración y los cambios asociados a la edad.
Es necesario identificar con marcadores específicos las células con mayor oxidación en los embriones (presumiblemente hemocitos). También conviene estudiar en detalle los mecanismos que hay detrás de los patrones de oxidación en los discos imaginales y durante el cierre dorsal.
El trabajo se relaciona directamente con la pregunta abierta de cómo los cambios locales del estado redox influyen en la diferenciación celular y la morfogénesis. También aborda el problema de la especificidad de la señalización redox: por qué un mismo oxidante provoca respuestas distintas en compartimentos distintos. Para la biología del desarrollo, el reto clave es entender qué proteínas se oxidan exactamente en las zonas detectadas y cómo eso modifica su función.
El sensor HyPer7 es tan sensible que puede registrar la oxidación producida por una sola molécula de peróxido de hidrógeno que haya difundido hasta la zona de reacción. Además, se reduce por el sistema de tiorredoxina, es decir, en realidad no muestra solo la presencia de peróxido, sino el equilibrio entre oxidación y reducción.
La idea de ver moléculas señalizadoras invisibles dentro de una célula viva conecta con el concepto de «visión interior» de la novela Solaris, de Stanisław Lem, donde un océano inteligente se comunica mediante sutiles señales químicas. Aquí los científicos consiguen observar literalmente el lenguaje químico de las células en acción.
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