Масс-спектрометрия с водородно-дейтериевым обменом (HDX/MS) стала стандартным инструментом для изучения структуры и динамики белков, а в последние годы успешно применяется и к ДНК-олигонуклеотидам. Однако классический подход имеет принципиальное ограничение: если в растворе сосуществуют несколько конформаций с одинаковой массой, измеряемая кинетика обмена представляет собой усреднённое значение, взвешенное по их относительному содержанию. Это особенно актуально для G-квадруплексов (G4) — неканонических структур ДНК, которые часто образуют сложные смеси конформеров в динамическом равновесии. Ранее группа авторов показала, что HDX/MS позволяет различать ансамбли с разным числом тетрад гуанина за счёт различий в стехиометрии связывания катионов, но конформеры с одинаковым числом тетрад оставались неразличимыми. В данной работе авторы добавляют третье измерение — ионную подвижность (IMS), которая разделяет ионы по их форме и заряду, что открывает путь к конформационно-специфичной кинетике.
Эксперименты проводились на приборе Agilent DT-IMS Q-TOF 6560, где ионы проходят через дрейфовую трубку, заполненную гелием, под действием однородного электрического поля. Время прибытия иона зависит от его сечения столкновения (CCS) и заряда, что позволяет разделять конформации с одинаковым отношением массы к заряду (m/z). Для водородно-дейтериевого обмена использовалась ранее разработанная схема непрерывного потока: шприц с образцом и шприц с обменным буфером соединялись через смесительный тройник, что позволяло получать разные временные точки обмена. После разделения по m/z и по времени дрейфа (ATD) для каждой популяции строились кривые обмена (зависимость числа необменявшихся сайтов от времени). Для разделения перекрывающихся пиков ATD применялась деконволюция гауссовыми функциями. В некоторых случаях для увеличения разрешения повышали напряжение на фрагменторе, но ниже порога газофазного разворачивания. Для интерпретации бимодальных изотопных распределений использовалось программное обеспечение OligoR, позволяющее разделить вклады EX1 и EX2 механизмов обмена.
Авторы продемонстрировали три сценария применения HDX/IMS-MS. В первом случае для теломерной последовательности 23TAG, образующей смесь гибридных конформаций hybrid-1 и hybrid-2 с одинаковой массой, удалось разделить их по времени дрейфа и измерить индивидуальные скорости обмена. Оказалось, что hybrid-2 обменивается быстрее, чем hybrid-1, причём различие обусловлено не локальными флуктуациями, а более высокой скоростью частичного разворачивания (EX1 механизм): k_op ≈ 1.76 мин⁻¹ против 0.57 мин⁻¹. Для последовательности 5YEY удалось разделить три популяции с разными CCS и показать, что одна из них обменивается исключительно по EX2 механизму (без разворачивания), а две другие демонстрируют вклад EX1 с разными скоростями. Во втором сценарии на примере 222T показано, что IMS позволяет отфильтровать неспецифически связанные катионы калия, которые имеют ту же массу, но другую форму. Это дало возможность получить «чистую» кинетику для специфических комплексов 2T·1K⁺ и 3T·2K⁺, исключив вклад быстрообменивающихся неструктурированных форм. В третьем сценарии обнаружено, что для мономорфных G4 (например, T30177TT) наблюдаются два пика в ATD, но скорости обмена для них идентичны, что указывает на газофазные перестройки одной и той же структуры из раствора, а не на разные конформации в растворе.
Работа существенно расширяет возможности HDX/MS для изучения нуклеиновых кислот, позволяя преодолеть фундаментальное ограничение, связанное с усреднением по конформациям одинаковой массы. В отличие от предыдущих исследований, где IMS использовалась отдельно для структурного анализа или HDX/MS для усреднённой кинетики, здесь впервые систематически объединены оба метода для получения конформационно-специфичных скоростей обмена. Это открывает путь к детальному изучению механизмов сворачивания и разворачивания ДНК-структур, а также к анализу сложных смесей, которые ранее были недоступны. Кроме того, работа демонстрирует, что IMS может служить фильтром для удаления артефактов неспецифического связывания, что повышает точность интерпретации данных HDX/MS в целом.
Метод может быть распространён на другие классы нуклеиновых кислот, включая РНК и модифицированные олигонуклеотиды, а также на комплексы нуклеиновых кислот с белками или лигандами. Дальнейшее улучшение разрешения IMS (например, с помощью циклотронной ионной подвижности или структур для потерь ионов) позволит разделять ещё более близкие конформации. Автоматизация анализа данных и разработка алгоритмов для многомерной деконволюции сделают метод более доступным для широкого круга исследователей. Перспективным также является сочетание с другими методами, такими как ионная спектроскопия или тандемная масс-спектрометрия с активацией, для получения дополнительной структурной информации.
Метод окажет влияние на структурную биологию нуклеиновых кислот, особенно в области изучения G-квадруплексов, которые являются мишенями для противораковых препаратов. Он также будет полезен в разработке терапевтических олигонуклеотидов и наноструктур на основе ДНК.
Применить метод к более широкому набору последовательностей, включая РНК-квадруплексы и мутантные формы, связанные с заболеваниями. Исследовать влияние различных катионов и лигандов на конформационную динамику с разрешением по отдельным конформерам.
В области структурной биологии нуклеиновых кислот остаётся нерешённой проблема определения полного конформационного ландшафта G-квадруплексов в физиологических условиях. Данный метод приближает решение, позволяя связывать газофазные наблюдения с поведением в растворе и выявлять скрытые промежуточные состояния.
Гуаниновые квадруплексы могут образовывать структуры, напоминающие стопку блинов: плоские тетрады гуанина укладываются друг на друга, а между ними, как начинка, сидят ионы калия.
Идея разделения молекул по форме в газовой фазе напоминает вымышленный «сортировщик» из рассказа Филипа Дика, где объекты классифицируются по неочевидным признакам. Только здесь вместо фантастического устройства — дрейфовая трубка с гелием.
Работа опубликована не на arXiv. Здесь её страница, PDF и формализация: проверить можно самим, а не только прочитать наш разбор.