El envejecimiento es un factor de riesgo común para muchas enfermedades oculares, como la degeneración macular asociada a la edad, el glaucoma, las cataratas y la retinopatía diabética. Los organismos modelo tradicionales, como los ratones y el pez cebra, viven demasiado tiempo, lo que dificulta el estudio de los cambios asociados a la edad. El pez killi africano (Nothobranchius furzeri) es el vertebrado más longevo que se reproduce en laboratorio (4–6 meses), y presenta muchos signos de envejecimiento, como daño en el ADN, senescencia celular y disminución de la agudeza visual. Sin embargo, los recursos genómicos existentes para el killi son limitados: el antiguo referente Nfu_20140520 está incompleto, y el nuevo NfurGRZ-RIMD1, aunque es más completo, tiene un transcriptoma mal anotado (casi la mitad de los genes se denominan 'LOC###'). Esto limita el análisis de la expresión génica y la integración con datos epigenéticos. El trabajo llena ese vacío al crear un transcriptoma de retina mejorado a partir de lecturas largas de ARN.
Se utilizaron retinas de killis jóvenes (8 semanas) y viejos (22 semanas) para extraer ARN total. Las bibliotecas de ADNc de longitud completa se prepararon con el protocolo PacBio Kinnex y luego se secuenciaron en la plataforma PacBio Revio. Las lecturas largas obtenidas se procesaron con el flujo de trabajo Iso-Seq: desmultiplexación, identificación de transcritos de longitud completa no quiméricos, agrupamiento y colapso de isoformas. Después, los transcritos se clasificaron y filtraron con SQANTI3, usando 37 conjuntos publicados de RNA-seq masivo de retina para validar los sitios de empalme. Los marcos de lectura abiertos se predijeron con el programa TransDecoder, y la anotación funcional se realizó con EggNOG-mapper utilizando ortología con peces teleósteos. Para comprobar la utilidad del nuevo transcriptoma, se volvieron a analizar datos publicados de RNA-seq masivo (14 tejidos) y de RNA-seq de célula única (retina de 6, 12 y 18 semanas), comparando el mapeo con tres referentes: Nfu_20140520, NfurGRZ-RIMD1 y el nuevo transcriptoma PacBio.
El nuevo transcriptoma contiene 21 014 genes y 165 015 transcritos, de los cuales más del 53% son isoformas nuevas. La proporción de genes con nombres biológicamente significativos aumentó del 52,9% en NfurGRZ-RIMD1 al 71,9%, y la proporción de 'LOC###' disminuyó del 47,1% a menos del 1%. Al volver a mapear el RNA-seq masivo, la proporción de lecturas mapeadas aumentó en la mayoría de los tejidos, especialmente en los nerviosos (retina, cerebro, médula espinal), pero disminuyó en hígado, grasa e intestino. En el RNA-seq de célula única, la proporción de lecturas mapeadas creció un 6–8% en comparación con NfurGRZ-RIMD1 y un 10–12% en comparación con Nfu_20140520, y el número de células detectadas aumentó un 24–26%. El análisis de expresión diferencial entre retinas de 21 y 7 semanas identificó 1683 genes, de los cuales el 80,2% tienen nombres ortólogos en humanos. Entre ellos se confirmaron genes previamente validados como optn, nfkb2 y pcdh15. El análisis de trayectorias de expresión reveló grupos relacionados con el envejecimiento: disminución de la expresión de genes mitocondriales y de traducción, aumento de genes de inflamación, angiogénesis y remodelación de la matriz extracelular. El nuevo transcriptoma también permitió anotar correctamente genes que antes faltaban, como crx, nr2e3, rho y otros. Se detectó la pérdida de expresión asociada a la edad de uno de los dos genes de opsina verde rh2 duplicados en tándem (PB.6621), confirmada mediante hibridación en cadena in situ.
El trabajo proporciona un transcriptoma mejorado de la retina del killi que aumenta la precisión del análisis de la expresión génica durante el envejecimiento. En comparación con recursos anteriores, el nuevo transcriptoma contiene más isoformas de longitud completa y anotaciones funcionales, lo que permite un análisis más completo de las rutas y una mejor interpretación biológica. A diferencia de un estudio reciente del telencéfalo, este trabajo utiliza el nuevo ensamblaje cromosómico NfurGRZ-RIMD1 e incluye una comparación directa de tres referentes sobre los mismos datos, demostrando las ventajas del nuevo recurso. Esto convierte al killi en un modelo más potente para estudiar las enfermedades retinales asociadas a la edad.
En el futuro será necesario crear un transcriptoma consensuado útil para todos los tejidos del killi, ya que el recurso actual está optimizado para la retina y el sistema nervioso. También se necesita la integración con datos epigenéticos para estudiar los mecanismos del envejecimiento. Mejorar la anotación del genoma y del transcriptoma abrirá oportunidades para investigar a nivel de isoformas y de regulación del empalme durante el envejecimiento.
El nuevo transcriptoma mejorará la investigación sobre el envejecimiento de la retina y la neurodegeneración en el modelo del killi. También puede ser útil para la genómica comparada de peces y el estudio de la evolución de los pigmentos visuales.
El siguiente paso será ampliar el transcriptoma a otros tejidos y crear un referente único para todo el organismo. También se planea utilizar el nuevo recurso para un análisis detallado de los cambios de empalme e isoformas asociados a la edad en la retina.
El trabajo resuelve el problema de la anotación incompleta del genoma en un nuevo sistema modelo, que limitaba la interpretación de los datos transcriptómicos. Esto se relaciona directamente con preguntas no resueltas sobre los mecanismos moleculares de las enfermedades retinales asociadas a la edad, como la degeneración macular asociada a la edad, donde los cambios en la expresión génica desempeñan un papel clave.
El pez killi africano vive solo 4–6 meses, pero su retina envejece igual que la humana: se acumulan daños en el ADN y disminuye la agudeza visual. Además, tiene dos genes de opsina verde casi idénticos, y con la edad uno de ellos «se calla».
En la novela de Alan Dean Foster «El don del hombre inútil», los extraterrestres viven muy poco, pero poseen una biología compleja. El killi, como modelo de envejecimiento acelerado, recuerda a esas especies ficticias y permite estudiar procesos que en el ser humano se prolongan durante décadas.
No publicado en arXiv. Aquí están su página, el PDF y la formalización: puede comprobarlo usted mismo, no solo leer nuestro análisis.