La complejidad transcriptómica del cerebro sigue estando mal caracterizada a nivel de isoformas: las lecturas cortas (unos 200 pares de bases) no pueden ensamblar transcritos completos, y los protocolos manuales de secuenciación de lectura larga son laboriosos y sensibles a la degradación del ARN en tejidos post mortem. En torno a este problema ya han aparecido trabajos sobre la automatización del análisis de datos celulares y la aplicación de redes neuronales a señales físicas, pero para el cerebro humano post mortem no existía una solución integral y escalable.
SALRR automatiza la preparación de bibliotecas de ADNc de Oxford Nanopore en la plataforma Hamilton Microlab NGS STAR, lo que reduce el tiempo manual en un 67% y aumenta la capacidad de 8 a 24 bibliotecas por persona y día. La parte computacional en Snakemake incluye el basecalling con Dorado, el filtrado de lecturas de longitud completa con Pychopper, el alineamiento con minimap2 contra el genoma GRCh38, la reconstrucción de transcritos con IsoQuant y StringTie seguidas de una fusión mediante Isomatch, y la clasificación de isoformas nuevas por categorías estructurales con SQANTI. Para el control de calidad y la calibración se usaron controles spike-in SIRV-Set 4.
En 13 bibliotecas se obtuvieron en promedio 68,8 millones de lecturas, una longitud mediana de 2 064 pb, una calidad Q24.91 y una tasa de mapeo del 99,93%. La preparación automática no es inferior a la manual en rendimiento de bibliotecas ni en tasa de mapeo, y solo reduce ligeramente la longitud mediana de las lecturas alineadas (1,7 frente a 2,0 kb). Con RIN de 8,2 a 10, el rendimiento de las bibliotecas correlacionó con el RIN (r=0,70), pero el número de lecturas y de transcritos anotados se mantuvo estable. La correlación de expresión con lecturas cortas fue de r=0,742 a nivel de genes y de r=0,760 a nivel de transcritos; la precisión de la cuantificación según los controles ERCC fue de r=0,939–0,943. Se detectaron 31 607 isoformas expresadas de 10 075 genes, de las cuales 8 532 son nuevas (27%), con predominio de retención de intrones, nuevas combinaciones de uniones conocidas y extremos 3' alternativos. En los loci GBA1, CCNF, CHCHD10 y TREM2, las lecturas largas resolvieron más isoformas que las cortas, incluidas dos nuevas isoformas de GBA1 (ISOMT_8486 e ISOMT_8487) con una estructura 5' alternativa.
A diferencia de trabajos cercanos sobre la aplicación del aprendizaje automático a datos celulares y físicos, SALRR resuelve una tarea estrictamente biológica: hace que la secuenciación de lectura larga del cerebro sea reproducible y escalable. Es la primera plataforma que elimina a la vez la baja capacidad de los protocolos manuales, la sensibilidad a la calidad del ARN y la fragmentación de las herramientas computacionales. Abre la posibilidad de realizar estudios poblacionales de la diversidad de isoformas en la neurodegeneración, que antes eran irrealizables.
La arquitectura modular de SALRR permite incorporar nuevas tecnologías sin rediseñarla. Su ampliación a la secuenciación de ARN de lectura larga de célula única y espacial permitirá resolver el uso de isoformas específico de cada tipo celular, algo crítico para entender la heterogeneidad de las enfermedades neurodegenerativas. La plataforma ya se está aplicando a cientos de muestras de cerebro con enfermedad de Alzheimer y demencias relacionadas en el marco de la CARD Long-Read Sequencing Initiative.
Los resultados influirán en la neurogenómica, la transcriptómica poblacional y la investigación de enfermedades neurodegenerativas, al ofrecer una resolución de isoformas inaccesible para las lecturas cortas.
Aplicar SALRR a grandes cohortes de cerebro post mortem, incluidas las cientos de muestras de CARD, e integrar los datos con perfiles genómicos y epigenómicos de lectura larga armonizados de los mismos donantes.
El trabajo se relaciona directamente con un problema no resuelto de la neurogenómica: cómo el cambio de isoformas influye en la función de las neuronas y en la predisposición a enfermedades cuando la expresión total del gen no cambia. SALRR proporciona una herramienta para cartografiar sistemáticamente estos eventos en el cerebro humano.
La longitud mediana de la cola de poli(A) de los transcritos nucleares fue de 143 nucleótidos, mientras que la de los mitocondriales fue de solo 41, lo que refleja una peculiaridad conocida del ARNm mitocondrial.
En la novela de Greg Egan «Ciudad permutación», copiar la conciencia exige descifrar por completo los estados moleculares de las neuronas; SALRR acerca la realidad a ese nivel de detalle, al mostrar una diversidad de isoformas que antes era invisible.
No publicado en arXiv. Aquí están su página, el PDF y la formalización: puede comprobarlo usted mismo, no solo leer nuestro análisis.