El trabajo se inscribe en la serie de investigaciones dedicadas a cómo la célula maneja el ADN: junto a él están los artículos sobre la reparación de extremos rotos del ADN, sobre los motores que fijan el tamaño de las gotas, sobre el ensamblaje rápido de copias del ADN y sobre la lectura del ADN por una red neuronal molécula a molécula. Todos abordan una tarea común: cómo las máquinas proteicas encuentran el tramo de ADN que buscan y se mantienen en él. En este artículo se toma el telómero, el extremo del cromosoma que hay que distinguir de una rotura casual. La proteína Cdc13 de las levaduras se encarga de esa distinción, pero hasta ahora no estaba claro en qué forma se posa sobre el ADN telomérico: si directamente como dímero o monómero a monómero.
Se emplearon dos técnicas complementarias de moléculas individuales. En la primera, smFRET, se colocó un par de colorantes, donador y aceptor, en el extremo del ADN con una secuencia telomérica de 12 nucleótidos. Cuando la proteína se une al tramo monocatenario situado entre los colorantes, la distancia entre ellos aumenta y la eficiencia de la transferencia de energía disminuye. Así se logró distinguir tres estados: ADN libre, complejo con una proteína y complejo con dos. En la segunda técnica, CoSMoS, se marcó la propia proteína con una etiqueta fluorescente y se observó cuántas moléculas de proteína se posan sobre un mismo ADN, contando los escalones de fotoblanqueo. Además, se comprobó el papel de dominios concretos de la proteína mediante mutantes: uno no sabe dimerizar y el otro no sabe unirse al ADN.
Se descubrió que Cdc13 se une al ADN telomérico en dos etapas. Primero, un monómero se posa sobre el ADN y forma el estado intermedio II. Después se incorpora el segundo monómero y surge el estado estable III. El mutante incapaz de dimerizar se detiene en el estado II, mientras que el mutante incapaz de unirse al ADN no produce ninguno de los estados. El recuento directo de moléculas en CoSMoS lo confirmó: sobre el ADN telomérico corto de 12 nucleótidos se posan como máximo dos proteínas, y sobre el más largo, de 25 nucleótidos, hasta cuatro. El complejo de dos Cdc13 sobre el ADN resultó resistente a un aumento de la concentración de sal hasta 100 mM, mientras que el complejo con una sola proteína se deshacía. El análisis cinético mostró que la unión secuencial de los monómeros es 8 veces más rápida que la unión directa del dímero ya formado.
El trabajo se distingue de las investigaciones vecinas en que, por primera vez, muestra de forma directa y a nivel de moléculas individuales el orden de ensamblaje del complejo proteico sobre el telómero. Antes se sabía de la dimerización de Cdc13 por bioquímica en disolución, pero no se veía cómo ocurría sobre el propio ADN. Ahora queda claro que la célula usa un mecanismo de dos pasos: el primer paso, rápido y reversible, sirve para comprobar la especificidad, y el segundo bloquea el complejo. Se parece a cómo funcionan otras proteínas que se unen al ADN, por ejemplo LexA en las bacterias o los factores de transcripción Fos y Jun en los eucariotas, pero en los telómeros se demuestra por primera vez.
El siguiente paso es ver la estructura del complejo de dos Cdc13 sobre el ADN de 12 nucleótidos con resolución atómica. Eso explicará por qué para una unión estable se necesitan los dos dominios de unión al ADN, aunque una sola proteína sea capaz de cubrir casi toda la longitud de la cola telomérica. También interesa comprobar cómo influyen en este proceso los compañeros de Cdc13, las proteínas Stn1 y Ten1, que junto con él forman el complejo CST. Es posible que estabilicen o, al contrario, regulen el ensamblaje del dímero sobre el telómero.
Los resultados son importantes para entender cómo la célula protege los extremos de los cromosomas y mantiene su longitud. Este conocimiento puede ser útil en la investigación del envejecimiento y del cáncer, donde los telómeros desempeñan un papel clave.
Determinar la estructura del complejo dimérico de Cdc13 con el ADN telomérico mediante criomicroscopía electrónica o cristalografía de rayos X. Comprobar cómo influyen las proteínas Stn1 y Ten1 en la cinética de ensamblaje y en la estabilidad del complejo.
En la biología de los telómeros sigue abierta una pregunta: cómo distingue la célula un extremo real del cromosoma de una rotura bicatenaria casual y no pone en marcha la reparación en el lugar equivocado. El mecanismo de unión secuencial de Cdc13 puede formar parte de esa distinción: el primer monómero se disocia rápido de los tramos inespecíficos, y la formación del dímero estable solo ocurre sobre la secuencia telomérica correcta. Esto conecta el trabajo con el problema general de la especificidad de las interacciones proteína-ADN.
La constante de disociación del complejo de Cdc13 con el ADN telomérico ronda 1 nanomolar: esto significa que, con una concentración de proteína de tan solo una molécula por cada mil millones de moléculas de agua, la mitad del ADN ya está unido. Para comparar, la constante de disociación típica de muchas enzimas con su sustrato se sitúa en el rango micromolar, es decir, mil veces más débil.
No publicado en arXiv. Aquí están su página, el PDF y la formalización: puede comprobarlo usted mismo, no solo leer nuestro análisis.