método

PCR

PCR is a method for amplifying specific DNA sequences through repeated cycles of heating and cooling.
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Descripción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método enzimático de amplificación (copia múltiple) de ADN en un tubo de ensayo (in vitro). Permite sintetizar selectivamente una enorme cantidad de copias de un fragmento definido de ADN, utilizando una ADN polimerasa termoestable (enzima que resiste altas temperaturas) y ciclos de cambio de temperatura. El método revolucionó la biología molecular, la medicina y la criminalística.

Historia

El concepto de amplificación de ADN mediante ciclos repetidos de replicación fue propuesto por Kary Mullis en 1983, mientras trabajaba en la empresa biotecnológica Cetus Corporation. La idea se le ocurrió durante un viaje nocturno por una autopista de California. Los primeros experimentos con el fragmento de Klenow (inestable a altas temperaturas) eran laboriosos, ya que la enzima debía añadirse después de cada ciclo de desnaturalización. El avance clave fue el uso de la ADN polimerasa Taq termoestable, aislada de bacterias termófilas de Yellowstone, lo que permitió automatizar el proceso. En 1993, Mullis recibió el Premio Nobel de Química. Desde entonces, el método se ha perfeccionado continuamente: surgieron la PCR en tiempo real (qPCR), la PCR digital y otras variantes.

Cómo funciona

El proceso consta de tres etapas principales: (1) Desnaturalización a ~95 °C: ruptura de los enlaces de hidrógeno entre las cadenas complementarias de ADN, formando moldes de cadena sencilla. (2) Hibridación de cebadores a ~50–65 °C: unión específica de los cebadores cortos de oligonucleótidos a los sitios complementarios en los moldes. (3) Elongación a ~72 °C: la ADN polimerasa termoestable sintetiza una nueva cadena de ADN, comenzando desde el extremo 3' del cebador y usando desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) como bloques de construcción. Los ciclos se repiten 25–40 veces en un termociclador. El parámetro clave es la especificidad, lograda mediante la selección de cebadores y la optimización de la temperatura de hibridación. La versión cuantitativa (qPCR) utiliza sondas fluorescentes para monitorizar la acumulación del producto en tiempo real, lo que permite determinar la cantidad inicial de molde.

En la práctica

Base de las pruebas de COVID-19, pruebas de paternidad y búsqueda de criminales a partir de una gota de sangre.

Dato curioso

La sensibilidad de la PCR es tal que, teóricamente, se puede detectar una sola molécula de ADN en una muestra. Por eso las pruebas del coronavirus podían detectar la infección en las etapas más tempranas.

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