La complexité transcriptomique du cerveau reste mal caractérisée au niveau des isoformes : les lectures courtes (environ 200 paires de bases) ne peuvent pas assembler des transcrits complets, et les protocoles manuels de séquençage à lecture longue sont laborieux et sensibles à la dégradation de l'ARN dans les tissus post-mortem. Autour de cette question, des travaux ont déjà vu le jour sur l'automatisation de l'analyse de données cellulaires et l'application de réseaux de neurones à des signaux physiques, mais il n'existait pas de solution globale et évolutive pour le cerveau humain post-mortem.
SALRR automatise la préparation des banques d'ADNc Oxford Nanopore sur la plateforme Hamilton Microlab NGS STAR, réduisant le temps manuel de 67 % et augmentant la capacité de 8 à 24 banques par personne et par jour. La partie informatique sous Snakemake comprend l'appel de bases Dorado, le filtrage des lectures pleine longueur Pychopper, l'alignement minimap2 sur le génome GRCh38, la reconstruction des transcrits IsoQuant et StringTie avec fusion ultérieure via Isomatch, et la classification des nouvelles isoformes par catégories structurelles SQANTI. Pour le contrôle qualité et la calibration, des contrôles spike-in SIRV-Set 4 ont été utilisés.
Sur 13 banques, on a obtenu en moyenne 68,8 millions de lectures, une longueur médiane de 2 064 pb, une qualité Q24.91 et une proportion d'alignement de 99,93 %. La préparation automatique ne le cède pas à la préparation manuelle en termes de rendement des banques et de proportion d'alignement, réduisant seulement un peu la longueur médiane des lectures alignées (1,7 contre 2,0 kpb). Pour un RIN de 8,2 à 10, le rendement des banques corrélait avec le RIN (r=0,70), mais le nombre de lectures et de transcrits annotés restait stable. La corrélation d'expression avec les lectures courtes était de r=0,742 au niveau des gènes et de r=0,760 au niveau des transcrits ; la précision de la quantification sur les contrôles ERCC était de r=0,939–0,943. On a détecté 31 607 isoformes exprimées issues de 10 075 gènes, dont 8 532 nouvelles (27 %), avec une prédominance de la rétention d'introns, de nouvelles combinaisons de jonctions connues et d'extrémités 3' alternatives. Dans les locus GBA1, CCNF, CHCHD10 et TREM2, les lectures longues ont résolu plus d'isoformes que les lectures courtes, y compris deux nouvelles isoformes de GBA1 (ISOMT_8486 et ISOMT_8487) avec une structure 5' alternative.
Contrairement aux travaux voisins sur l'application de l'apprentissage automatique à des données cellulaires et physiques, SALRR résout une tâche purement biologique : rendre le séquençage à lecture longue du cerveau reproductible et évolutif. C'est la première plateforme qui élimine à la fois la faible capacité des protocoles manuels, la sensibilité à la qualité de l'ARN et la fragmentation des outils informatiques. Elle ouvre la possibilité d'études populationnelles de la diversité des isoformes dans la neurodégénérescence, qui étaient auparavant irréalisables.
L'architecture modulaire de SALRR permet d'intégrer de nouvelles technologies sans reconception. Son extension au séquençage d'ARN à lecture longue en cellule unique et spatial permettra de résoudre l'utilisation des isoformes propre à chaque cellule, ce qui est essentiel pour comprendre l'hétérogénéité des maladies neurodégénératives. La plateforme est déjà appliquée à des centaines d'échantillons de cerveau dans la maladie d'Alzheimer et les démences apparentées dans le cadre de la CARD Long-Read Sequencing Initiative.
Les résultats auront un impact sur la neurogénomique, la transcriptomique populationnelle et les études sur les maladies neurodégénératives, en fournissant une résolution des isoformes inaccessible aux lectures courtes.
Appliquer SALRR à de grandes cohortes de cerveaux post-mortem, notamment des centaines d'échantillons CARD, et intégrer les données avec des profils génomiques et épigénétiques à lecture longue concordants des mêmes donneurs.
Le travail est directement lié à un problème non résolu de la neurogénomique : comment le changement d'isoforme influence la fonction des neurones et la prédisposition aux maladies, lorsque l'expression globale du gène ne change pas. SALRR fournit un outil pour cartographier systématiquement ces événements dans le cerveau humain.
La longueur médiane de la queue poly(A) des transcrits nucléaires était de 143 nucléotides, tandis que celle des transcrits mitochondriaux n'était que de 41, ce qui reflète une particularité connue des ARNm mitochondriaux.
Dans le roman de Greg Egan « La Cité des permutants », la copie de la conscience exige le décodage complet des états moléculaires des neurones ; SALRR rapproche la réalité d'un tel niveau de détail, en montrant une diversité d'isoformes auparavant invisible.
Non publié sur arXiv. Voici sa page, le PDF et la formalisation : vous pouvez vérifier vous-même, pas seulement lire notre analyse.