La espectrometría de masas con intercambio hidrógeno-deuterio (HDX/MS) se ha convertido en una herramienta estándar para estudiar la estructura y la dinámica de las proteínas, y en los últimos años se aplica con éxito también a oligonucleótidos de ADN. Sin embargo, el enfoque clásico tiene una limitación fundamental: si en disolución coexisten varias conformaciones con la misma masa, la cinética de intercambio que se mide es un valor promedio ponderado por su abundancia relativa. Esto es especialmente relevante para los cuádruplex de guanina (G4), estructuras de ADN no canónicas que a menudo forman mezclas complejas de conformeros en equilibrio dinámico. Anteriormente, el grupo de autores demostró que la HDX/MS permite distinguir conjuntos con distinto número de tetradas de guanina gracias a las diferencias en la estequiometría de unión de cationes, pero los conformeros con el mismo número de tetradas seguían siendo indistinguibles. En este trabajo, los autores añaden una tercera dimensión, la movilidad iónica (IMS), que separa los iones según su forma y su carga, lo que abre el camino hacia una cinética específica de cada conformación.
Los experimentos se realizaron en un instrumento Agilent DT-IMS Q-TOF 6560, en el que los iones atraviesan un tubo de deriva lleno de helio bajo la acción de un campo eléctrico uniforme. El tiempo de llegada de un ion depende de su sección eficaz de colisión (CCS) y de su carga, lo que permite separar conformaciones con la misma relación masa-carga (m/z). Para el intercambio hidrógeno-deuterio se utilizó un esquema de flujo continuo desarrollado previamente: una jeringa con la muestra y otra con el tampón de intercambio se conectaban mediante una T de mezcla, lo que permitía obtener distintos puntos temporales de intercambio. Tras la separación por m/z y por tiempo de deriva (ATD), se construyeron curvas de intercambio para cada población (la dependencia del número de sitios no intercambiados con el tiempo). Para separar picos de ATD solapados se aplicó una deconvolución con funciones gaussianas. En algunos casos, para aumentar la resolución se elevó el voltaje del fragmentador, pero por debajo del umbral de desplegamiento en fase gaseosa. Para interpretar las distribuciones isotópicas bimodales se utilizó el programa OligoR, que permite separar las contribuciones de los mecanismos de intercambio EX1 y EX2.
Los autores demostraron tres escenarios de aplicación de la HDX/IMS-MS. En el primero, para la secuencia telomérica 23TAG, que forma una mezcla de conformaciones híbridas hybrid-1 y hybrid-2 con la misma masa, se logró separarlas por su tiempo de deriva y medir sus velocidades de intercambio individuales. Resultó que hybrid-2 intercambia más rápido que hybrid-1, y la diferencia no se debe a fluctuaciones locales, sino a una mayor velocidad de desplegamiento parcial (mecanismo EX1): k_op ≈ 1.76 min⁻¹ frente a 0.57 min⁻¹. Para la secuencia 5YEY se consiguieron separar tres poblaciones con distinto CCS y se demostró que una de ellas intercambia exclusivamente por el mecanismo EX2 (sin desplegamiento), mientras que las otras dos presentan una contribución EX1 con velocidades diferentes. En el segundo escenario, con el ejemplo de 222T, se muestra que la IMS permite filtrar los cationes de potasio unidos de forma inespecífica, que tienen la misma masa pero otra forma. Esto permitió obtener una cinética «limpia» para los complejos específicos 2T·1K⁺ y 3T·2K⁺, excluyendo la contribución de las formas no estructuradas de intercambio rápido. En el tercer escenario se descubrió que para los G4 monomórficos (por ejemplo, T30177TT) se observan dos picos en el ATD, pero sus velocidades de intercambio son idénticas, lo que indica reorganizaciones en fase gaseosa de una misma estructura procedente de la disolución, y no conformaciones distintas en disolución.
El trabajo amplía de forma sustancial las posibilidades de la HDX/MS para estudiar ácidos nucleicos, ya que permite superar una limitación fundamental: el promedio sobre conformaciones de la misma masa. A diferencia de investigaciones anteriores, en las que la IMS se usaba por separado para el análisis estructural o la HDX/MS para una cinética promediada, aquí se combinan por primera vez de manera sistemática ambos métodos para obtener velocidades de intercambio específicas de cada conformación. Esto abre el camino al estudio detallado de los mecanismos de plegamiento y desplegamiento de las estructuras de ADN, así como al análisis de mezclas complejas que antes resultaban inaccesibles. Además, el trabajo demuestra que la IMS puede servir como filtro para eliminar artefactos de unión inespecífica, lo que aumenta la precisión en la interpretación de los datos de HDX/MS en general.
El método puede extenderse a otras clases de ácidos nucleicos, como el ARN y los oligonucleótidos modificados, y también a complejos de ácidos nucleicos con proteínas o ligandos. La mejora adicional de la resolución de la IMS (por ejemplo, mediante movilidad iónica de ciclotrón o estructuras para la pérdida de iones) permitirá separar conformaciones aún más parecidas. La automatización del análisis de datos y el desarrollo de algoritmos para la deconvolución multidimensional harán que el método sea más accesible para un amplio círculo de investigadores. También es prometedora su combinación con otros métodos, como la espectroscopia iónica o la espectrometría de masas en tándem con activación, para obtener información estructural adicional.
El método influirá en la biología estructural de los ácidos nucleicos, sobre todo en el estudio de los cuádruplex de G, que son dianas de fármacos contra el cáncer. También será útil en el desarrollo de oligonucleótidos terapéuticos y de nanoestructuras basadas en ADN.
Aplicar el método a un conjunto más amplio de secuencias, incluidas las de cuádruplex de ARN y las formas mutantes asociadas a enfermedades. Investigar la influencia de distintos cationes y ligandos en la dinámica conformacional con resolución por conformero individual.
En el campo de la biología estructural de los ácidos nucleicos sigue sin resolverse el problema de determinar el panorama conformacional completo de los cuádruplex de G en condiciones fisiológicas. Este método acerca la solución, ya que permite relacionar las observaciones en fase gaseosa con el comportamiento en disolución y detectar estados intermedios ocultos.
Los cuádruplex de guanina pueden formar estructuras que recuerdan a una pila de tortitas: las tetradas planas de guanina se apilan unas sobre otras y entre ellas, como si fuera el relleno, se alojan los iones de potasio.
La idea de separar moléculas por su forma en fase gaseosa recuerda al «clasificador» ficticio de un relato de Philip Dick, donde los objetos se ordenan por rasgos poco evidentes. Solo que aquí, en lugar de un dispositivo fantástico, hay un tubo de deriva con helio.
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