La spectrométrie de masse couplée à l'échange hydrogène-deutérium (HDX/MS) est devenue un outil standard pour étudier la structure et la dynamique des protéines, et depuis quelques années elle s'applique avec succès aux oligonucléotides d'ADN. Cependant, l'approche classique présente une limitation fondamentale : si plusieurs conformations de même masse coexistent en solution, la cinétique d'échange mesurée n'est qu'une valeur moyenne pondérée par leur abondance relative. Cela vaut particulièrement pour les quadruplexes de guanine (G4), structures d'ADN non canoniques qui forment souvent des mélanges complexes de conformères en équilibre dynamique. Auparavant, le groupe d'auteurs avait montré que la HDX/MS permet de distinguer des ensembles comportant un nombre différent de tétrades de guanine grâce aux différences de stœchiométrie de liaison des cations, mais les conformères possédant le même nombre de tétrades restaient indiscernables. Dans ce travail, les auteurs ajoutent une troisième dimension, la mobilité ionique (IMS), qui sépare les ions selon leur forme et leur charge, ouvrant ainsi la voie à une cinétique spécifique de chaque conformation.
Les expériences ont été réalisées sur un instrument Agilent DT-IMS Q-TOF 6560, où les ions traversent un tube de dérive rempli d'hélium sous l'action d'un champ électrique uniforme. Le temps d'arrivée d'un ion dépend de sa section efficace de collision (CCS) et de sa charge, ce qui permet de séparer des conformations présentant le même rapport masse/charge (m/z). Pour l'échange hydrogène-deutérium, on a utilisé un schéma à flux continu développé précédemment : une seringue contenant l'échantillon et une seringue contenant le tampon d'échange étaient reliées par un raccord en T, ce qui permettait d'obtenir différents temps d'échange. Après séparation par m/z et par temps de dérive (ATD), des courbes d'échange (nombre de sites non échangés en fonction du temps) ont été construites pour chaque population. Pour séparer les pics ATD qui se chevauchent, une déconvolution par fonctions gaussiennes a été appliquée. Dans certains cas, la tension du fragmentateur a été augmentée pour améliorer la résolution, mais en restant sous le seuil de dépliage en phase gazeuse. Pour interpréter les distributions isotopiques bimodales, le logiciel OligoR a été utilisé, permettant de séparer les contributions des mécanismes d'échange EX1 et EX2.
Les auteurs ont démontré trois scénarios d'application de la HDX/IMS-MS. Dans le premier cas, pour la séquence télomérique 23TAG, qui forme un mélange de conformations hybrides hybrid-1 et hybrid-2 de même masse, il a été possible de les séparer par leur temps de dérive et de mesurer leurs vitesses d'échange individuelles. Il est apparu que hybrid-2 échange plus rapidement que hybrid-1, la différence étant due non pas à des fluctuations locales, mais à une vitesse plus élevée de dépliage partiel (mécanisme EX1) : k_op ≈ 1,76 min⁻¹ contre 0,57 min⁻¹. Pour la séquence 5YEY, trois populations de CCS différentes ont pu être séparées et l'on a montré que l'une d'elles échange exclusivement selon le mécanisme EX2 (sans dépliage), tandis que les deux autres présentent une contribution EX1 avec des vitesses différentes. Dans le deuxième scénario, sur l'exemple de 222T, il est montré que l'IMS permet de filtrer les cations potassium liés de manière non spécifique, qui ont la même masse mais une forme différente. Cela a permis d'obtenir une cinétique « pure » pour les complexes spécifiques 2T·1K⁺ et 3T·2K⁺, en excluant la contribution des formes non structurées à échange rapide. Dans le troisième scénario, il a été découvert que pour les G4 monomorphes (par exemple T30177TT), deux pics apparaissent dans l'ATD, mais que leurs vitesses d'échange sont identiques, ce qui indique des réarrangements en phase gazeuse d'une même structure issue de la solution, et non des conformations différentes en solution.
Ce travail élargit considérablement les possibilités de la HDX/MS pour l'étude des acides nucléiques, en permettant de surmonter une limitation fondamentale liée à la moyenne sur des conformations de même masse. Contrairement aux études précédentes, où l'IMS était utilisée séparément pour l'analyse structurale ou la HDX/MS pour une cinétique moyennée, les deux méthodes sont ici systématiquement combinées pour la première fois afin d'obtenir des vitesses d'échange spécifiques de chaque conformation. Cela ouvre la voie à une étude détaillée des mécanismes de repliement et de dépliage des structures d'ADN, ainsi qu'à l'analyse de mélanges complexes jusque-là inaccessibles. En outre, le travail démontre que l'IMS peut servir de filtre pour éliminer les artefacts de liaison non spécifique, ce qui améliore la précision de l'interprétation des données HDX/MS en général.
La méthode pourrait être étendue à d'autres classes d'acides nucléiques, notamment l'ARN et les oligonucléotides modifiés, ainsi qu'aux complexes d'acides nucléiques avec des protéines ou des ligands. Une amélioration supplémentaire de la résolution de l'IMS (par exemple grâce à la mobilité ionique à cyclotron ou à des structures pour pertes d'ions) permettra de séparer des conformations encore plus proches. L'automatisation de l'analyse des données et le développement d'algorithmes de déconvolution multidimensionnelle rendront la méthode plus accessible à un large éventail de chercheurs. La combinaison avec d'autres méthodes, telles que la spectroscopie ionique ou la spectrométrie de masse en tandem avec activation, est également prometteuse pour obtenir des informations structurales supplémentaires.
La méthode aura un impact sur la biologie structurale des acides nucléiques, en particulier dans l'étude des quadruplexes de guanine, qui sont des cibles pour les médicaments anticancéreux. Elle sera également utile pour le développement d'oligonucléotides thérapeutiques et de nanostructures à base d'ADN.
Appliquer la méthode à un ensemble plus large de séquences, y compris les quadruplexes d'ARN et les formes mutantes associées à des maladies. Étudier l'influence de différents cations et ligands sur la dynamique conformationnelle avec une résolution par conformère individuel.
Dans le domaine de la biologie structurale des acides nucléiques, la détermination du paysage conformationnel complet des quadruplexes de guanine dans des conditions physiologiques reste un problème non résolu. Cette méthode rapproche de la solution en permettant de relier les observations en phase gazeuse au comportement en solution et d'identifier des états intermédiaires cachés.
Les quadruplexes de guanine peuvent former des structures qui ressemblent à une pile de crêpes : des tétrades plates de guanine s'empilent les unes sur les autres, et entre elles, comme une garniture, se logent des ions potassium.
L'idée de séparer les molécules par leur forme en phase gazeuse rappelle le « trieur » imaginaire d'une nouvelle de Philip K. Dick, où les objets sont classés selon des critères peu évidents. Sauf qu'ici, à la place d'un dispositif fantastique, on trouve un tube de dérive rempli d'hélium.
Non publié sur arXiv. Voici sa page, le PDF et la formalisation : vous pouvez vérifier vous-même, pas seulement lire notre analyse.